A partir de 1546, Rodrigo de Castro vivió bajo la protección de su hermano, Pedro, que había sido promovido al obispado de Salamanca y que en 1548 fue designado capellán del todavía príncipe Felipe. Esto permitió a Rodrigo de Castro formar parte del séquito del futuro monarca, que en aquel año inició un gran periplo triunfal por los territorios del Imperio.
Volvió a acompañar a Felipe II en 1554, cuando viajo a Inglaterra, con motivo del matrimonio del Rey con la reina María Tudor. Al año siguiente marchó a Roma, comisionado —en calidad de secretario de la cifra— para ayudar a su otro hermano, Fernando Ruiz de Castro, marqués de Sarria, en su difícil pero exitosa embajada ante Paulo IV. En 1559, acreditado como hábil diplomático, regresó a España y recibió las órdenes sacerdotales en Cuenca. Poco después participó directamente, como consejero del Supremo Consejo de la Inquisición, en el largo proceso contra el arzobispo Carranza, arzobispo de Toledo.
A finales de 1564, fue comisionado por Felipe II para gestionar en Roma la autorización que permitiera dictar la sentencia a la propia Inquisición.
Tras varios meses de gestiones estériles, Rodrigo de Castro optó por sugerir una solución intermedia: el envío de un legado especial con amplios poderes, que sentenciara a Carranza en España.
Sus buenos oficios resultaron determinantes para alcanzar la concordia otorgada en Elvas, en la víspera de Navidad de 1580. Poco después, Rodrigo fue propuesto para regir la archidiócesis de Sevilla; pero antes de posesionarse de la misma debió atender una nueva comisión real: recibir en Barcelona a la infanta María, viuda del emperador Maximiliano II, y acompañarla después hasta Lisboa, donde Felipe II había previsto esperarla. Tras cumplir el encargo, en el que invirtió buena parte del año, Rodrigo todavía permaneció en Lisboa por espacio de nueve meses, interviniendo como testigo al propio tiempo en el proceso que se le siguió a Antonio Pérez, antiguo secretario real.
En el verano de 1598, Rodrigo de Castro se trasladó a la Corte, atendiendo a la llamada de Felipe II, quien falleció al poco de su llegada. En Madrid permaneció todavía varios meses y a comienzos de año se trasladó a Valencia, pues el difunto monarca le había comisionado para recibir en Vinaroz a la futura reina Margarita.
El Cardenal de Castro regresó a Sevilla a mediados de mayo, el cardenal Rodrigo de Castro, cuya vida se apagaría al poco de su regreso a Sevilla, destacó como desprendido protector de literatos y artistas, pero su memoria pervivió sobre todo por sus gestos y fundaciones, todas generosamente dotadas. Son bien conocidas en Sevilla las del Recogimiento de niñas perdidas y la Limosna anual para presos pobres, así como el amparo que prestó a los colegios de San Hermenegildo y San Gregorio y a otras fundaciones jesuitas en Jerez y Écija. Pero más que éstas destacaron las que beneficiaron a su Monforte natal; aquí concluyó el convento franciscano fundado por su abuelo, el conde Rodrigo Osorio, y continuado por su madre, la condesa Beatriz, que falleció sin verlas rematadas
En 1593 fundó además el magnífico Colegio de Nuestra Señora de la Antigua —más conocido como del Cardenal—, que fue su gran proyecto y cuya gestión dejó confiada a la Compañía de Jesús. Falleció el 18 de septiembre de 1600. Fue enterrado en la catedral de Sevilla y posteriormente, en 1603, de acuerdo con lo expresado en su testamento, que había otorgado el 12 de agosto de 1598, sus restos fueron trasladados a la iglesia del colegio monfortino que había dejado fundado.
